摘要：目的制备高水溶性的水飞蓟素-磺丁基-β-环糊精包合物。方法相溶解度法筛选环糊精包合材料，确定包合类型；正交试验法优选水飞蓟素包合物的工艺条件；对其溶解度进行测定并使用显微镜法、红外光谱分析、X-射线衍射分析对包合物结构进行表征。结果磺丁基-β-环糊精对水飞蓟素的增溶作用更强，确定其为包合材料，药物与环糊精按1∶n的方式进行包合；正交试验优选出的最佳工艺为水飞蓟素与磺丁基-β-环糊精的物质的量比1∶8，包合温度60℃，包合时间3h；溶解度、显微镜、红外光谱分析和X-射线衍射分析的结果均显示已形成包合物，且药物以非晶型或无定型存在于包合物中。结论成功制备水飞蓟素-磺丁基-β-环糊精包合物，其可显著提高水飞蓟素的溶解度，为其临床应用提供了实验基础。
水飞蓟素（silymarin，SM）是菊科药用植物水飞蓟果实的提取物，是天然的*酮木脂素类化合物，主要成分有花旗松素（taxifolin，TF）、水飞蓟亭（silychristin，SC）、水飞蓟宁（silydianin，SD）、水飞蓟宾（silybin，SB）以及异水飞蓟宾（isosilybin，ISB）[1]，在临床上治疗中*性肝损伤、肝硬化、慢性肝炎疗效显著[2]，但其水溶性和脂溶性均较差，生物利用度只有20%～40%[3]，使其临床应用受到限制。环糊精包合技术可显著提高药物的水溶性，药物制剂中常用的环糊精种类有β-环糊精（β-CD）、羟丙基-β-环糊精（HP-β-CD）、2,6-二甲基-β-环糊精（DM-β-CD）、磺丁基-β-环糊精（SBE-β-CD），本研究首先对环糊精的种类进行筛选，最终选用SBE-β-CD作为包合材料。SBE-β-CD是一种阴离子型高水溶性的环糊精衍生物，能很好地与药物分子包合形成非共价复合物，从而提高药物的稳定性，与其他β-CD衍生物相比具有增溶效果强、肾*性低、溶血作用小等优点[4]。辉瑞开发的抗精神病药Ziprasidone注射剂就是以SBE-β-CD作为包合材料，其分别于年和年获准在瑞典和美国上市[5-6]。本研究以SBE-β-CD为包合材料成功制备了SM环糊精包合物，并对SM的5个主要活性成分的包合率分别进行了测定，以了解每个成分的包合情况。
1仪器与材料
KQ-KDE型高功率数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；FD-2A真空冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）；Agilent型快速高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；DVCD型精密分析天平（上海奥豪斯仪器有限公司）；DF-S集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市子华仪器有限责任公司）；PHS-3C型精密pH计（上海雷磁科学仪器公司）。
SM原料药（批号，TF、SC、SD、SB、ISB质量分数分别为2.37%、11.74%、4.10%34.54%、6.04%，辽宁盘锦华成制药厂）；TF（批号，质量分数98.0%）、SC（批号1601，质量分数98.0%）、SD（批号，质量分数98.0%）、SB（批号，质量分数98.0%）、ISB（批号，质量分数98.0%），上海同田生物技术股份有限公司；HP-β-CD（批号，淄博千汇生物科技有限公司）；β-CD（批号）、DM-β-CD（批号）、SBE-β-CD（批号），山东滨州智源生物科技有限公司；甲醇（色谱纯，上海科丰化学试剂有限公司）；纯化水（实验室自制）。
2方法与结果
2.1SM分析方法的建立
2.1.1色谱条件高效液相色谱系统（DAD检测器），色谱柱为KromasilC18柱（mm×4.6mm，5μm），柱温40℃，进样量为20μL，检测波长为nm，以甲醇-0.05%磷酸水溶液为流动相，体积流量为1mL/min，进行梯度洗脱，洗脱程序见表1。
2.1.2溶液的制备
（1）供试品溶液：取包合物约mg，置于mL量瓶中，加少量甲醇超声溶解，再加甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
（2）对照品溶液：精密称取TF、SC、SD、SB、ISB对照品适量，置于mL量瓶中，加少量甲醇超声溶解，再加甲醇稀释至刻度，配制成质量浓度分别为73.2、80.4、73.0、.8、92.8μg/mL的对照品溶液。
2.1.3专属性考察称取SM原料药mg，放置于mL量瓶中，加甲醇适量，超声溶解之后，再加甲醇稀释至刻度，摇匀。精密移取此溶液1mL置于10mL量瓶中，加入65%甲醇稀释至刻度，即得供试品溶液。取适量空白溶剂、对照品溶液、供试品溶液，按“2.1.1”项色谱条件测定。结果见图1，表明空白溶剂对SM的测定无干扰。
2.1.4线性关系考察精密量取对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、2.0、2.5、5.0mL于10mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成TF质量浓度为0.7、1.5、3.0、6.0、12.0、15.1、18.8、37.4μg/mL；SC质量浓度为0.8、1.6、3.2、6.4、12.8、16.1、20.1、40.2μg/mL；SD质量浓度为0.7、1.5、3.0、6.0、11.9、15.0、18.7、37.5μg/mL；SB质量浓度为1.7、3.4、6.8、13.7、27.3、34.2、42.7、85.4μg/mL；ISB质量浓度为0.9、1.8、3.7、7.4、14.8、18.6、23.2、46.4μg/mL的混合对照品溶液，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，进样量为20μL，计算峰面积。峰面积为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X），得各成分的线性回归方程，结果见表2。
2.1.5精密度试验分别配制低、中、高3个质量浓度的5种成分对照品溶液，TF质量浓度分别为1.5、6.0、15.1μg/mL，SC质量浓度分别为3.2、12.8、20.1μg/mL，SD质量浓度分别为3.0、11.9、18.7μg/mL，SB质量浓度分别为6.8、34.2、85.4μg/mL，ISB质量浓度分别为3.7、14.8、23.2μg/mL，每个质量浓度连续进样5次，测定并计算其质量浓度，得日内精密度；以后连续5d测定并计算质量浓度，即得日间精密度。结果表明，日间和日内精密度相对标准偏差均小于2%，该方法精密度良好。
2.1.6重复性试验称取原料药mg，按“2.1.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件随机进样，依各成分峰的保留时间、峰面积计算各自RSD分别为1.7%、1.3%、1.8%、2.5%和2.6%，结果均小于3%，说明方法重复性良好。
2.1.7稳定性试验取供试品（批号）溶液，于0、2、4、6、8、10、12、24h取样测定，测得TF、SC、SD、SB、ISB峰面积RSD分别为0.64%、1.26%、0.84%、1.34%、0.61%，表明溶液在24h内稳定性良好。
2.1.8加样回收率试验取含有量已知供试品（批号）6份，每份约60mg（TF、SC、SD、SB、ISB质量分数分别为3.35、21.28、11.65、53.45、10.03mg/g），置于mL量瓶中，精密加入一定量对照品，在“2.1.1”项下色谱条件测定，计算加样回收率。结果TF、SC、SD、SB、ISB平均加样回收率分别为98.76%、98.65%、99.52%、99.88%、98.96%，RSD分别为0.96%、0.97%、0.72%、0.68%、1.03%。
2.1.9含量测定精密称取SM原料药，置于mL量瓶中加入甲醇溶解并用其稀释至刻度，经0.45μm的微孔滤膜滤过后，取20μL续滤液，进样测定。结果见表3。
2.1.10平衡溶解度的测定在pH1.2的盐酸溶液、蒸馏水（pH5.6）、pH7.5PBS、0.1%SDS、0.5%SDS以及1.0%SDS溶剂中加入过量SM原料药粉末，制备成过饱和溶液，每种溶剂平行制备3个样品，于（37±1）℃、r/min的恒温水浴中机械振荡24h，取样，并经孔径为0.45μm的微孔滤膜滤过，滤去初滤液，取20μL进样，测得续滤液中SM各有效成分的含量，将测定的3个样品取平均值，计算其各成分在各溶剂中的溶解度，结果见表4。
2.2环糊精包合物的制备
2.2.1环糊精包合材料的筛选参照Higuchi等[7]的方法，分别称取β-CD.4mg、HP-β-CD.3mg、DM-β-CD.3mg、SBE-β-CD.2mg置于mL量瓶中，少量纯化水超声溶解后，用纯化水稀释至刻度，即得1mmol/L的标准液。分别量取0、2、4、6、8、10mL各标准液置于10mL量瓶中，纯化水稀释至刻度，制成梯度浓度溶液，将过量SM原料药加入上述各梯度浓度溶液中，在37℃，r/min水浴振荡24h。静置后，0r/min离心7min，取上清液，0.45μm微孔滤膜滤过，将续滤液稀释10倍进样。以各环糊精的浓度为横坐标，SM浓度为纵坐标作图，得到相溶解度图，见图2。结果表明TF、SC、SD3种成分在不同浓度环糊精下的溶解度差别较小，SB与ISB在其溶解度大小为SBE-β-CD＞DM-β-CD＞HP-β-CD＞β-CD，故在以下实验中采用SBE-β-CD作为载体制备包合物。
SM各成分在SBE-β-CD溶液的相溶解度见图3，各成分的浓度随SBE-β-CD溶液浓度的增加而呈非线性增加，表明SBE-β-CD在该浓度范围内药物与环糊精形成的是1∶n（n＞1）的包合物。
2.2.2包合物的制备采用冷冻干燥法制备包合物，称取适量的SBE-β-CD，溶于一定量的纯化水中，制备成SBE-β-CD水溶液，称取SM原料药适量，加入少量的无水乙醇超声溶解，在一定温度下，缓慢滴加到SBE-β-CD水溶液中，磁力搅拌一定时间后，静置，再置于离心机中0r/min离心10min，过0.45μm的微孔滤膜后，取续滤液于4℃冰箱中冷藏4h，冷阱（?80℃）预冻5～6h，再置于冷冻干燥机中干燥24h，研磨过80目筛，即得。对其包封率和包合物得率进行测定。
包封率＝包合物中的药物含量/总投药量
包合物得率＝包合物的质量/(环糊精投入量＋投药量)
2.2.3单因素考察以包封率为考察指标，考察物质的量比、包合时间、包合温度对环糊精包合物的影响。
（1）物质的量比：通过“2.2.1”项研究结果可知，SBE-β-CD在0～1mmol/L内药物与环糊精形成1∶n（n＞1）的包合物，故选用物质的量比为1∶6、1∶8、1∶10、1∶12进行考察，见图4。结果表明，随着SM与SBE-β-CD物质的量比增加，各成分的包合率呈现出先上升后下降的趋势，故选用1∶6、1∶8、1∶10进行后续的正交试验。
（2）包合温度：本课题首先考察了40、50、60、70℃对其包合的影响（图5），但发现当包合温度为70℃时，SM药物出现不稳定的状态，故选用40、50、60℃进行后续的正交试验。
（3）包合时间：考察包合时间3、4、5、6h对环糊精包合的影响。结果表明，包合率并没有因为包合时间的增加而增加（图6），时间对环糊精包合的影响较小，考虑制剂工艺的耗时，选择3、4、5h进行后续的正交试验。
2.2.4正交试验考察指标为包封率和包合物得率，考虑因素为主客分子的物质的量比（A）、包合温度（B）及包合时间（C），依据L9(34)正交表进行试验，各因素水平设计见表5，实验结果见表6，方差分析结果见表7。
SM5种成分包封率的权重系数[8]分别为0.03、0.15、0.04、0.51、0.07，包合得率的权重系数为0.2，综合评分＝(TF包封率/最高TF包封率)×0.03×＋(SC包封率/最高SC包封率)×0.15×＋(SD包封率/最高SD包封率)×0.04×＋(SB包封率/最高SB包封率)×0.51×＋(ISB包封率/最高ISB包封率)×0.07×＋(包合得率/最高包合得率)×0.2×。
由方差分析结果可知，物质的量比、包合温度对包合结果的影响比包合时间大。综合分析结果，为了缩短生产周期，合理降低成本，确定最佳包合工艺为A2B3C1，即SM与SBE-β-CD的物质的量比为1∶8，包合温度60℃，包合时间3h。取SM3份，按最佳包合工艺制备3批包合物（批号、、），TF的包封率为28.18%（n＝3，RSD＝2.13%）、SC的包封率为26.56%（n＝3，RSD＝2.17%）、SD的包封率为28.55%（n＝3，RSD＝0.87%）、SB的包封率为72.95%（n＝3，RSD＝4.87%）、ISB的包封率为27.79%（n＝3，RSD＝3.29%），包合物得率为85.34%（n＝3，RSD＝2.13%）。结果表明，该SM的包合工艺条件稳定，具有重复性和可操作性。
2.3包合物的验证
2.3.1包合物平衡溶解度的测定取过量的SM包合物，按照“2.1.10”项下方法测定其平衡溶解度，结果见表8。由表8可知，将SM制成包合物之后，其在不同介质中的溶解度均有所提高，故采用包合技术可显著提高难溶性药物SM的溶解度。
2.3.2显微镜法分别取SM原料药、SBE-β-CD、物理混合物（称取处方量的药物与载体，研细，以等量递加法充分混合后过80目筛，即得）和包合物粉末少许，置于载玻片上，然后将载玻片置于显微镜物镜下，调节放大倍数为20×40，分别对各样品图像采集，结果见图7。结果显示，在SM原料药、SBE-β-CD、SM和SBE-β-CD的物理混合物的显微镜视野中，几种物质单独游离存在，而在SM环糊精包合物的显微镜视野中，看不到游离的药物和SBE-β-CD，而是以一种新的物质形态存在，由此可初步判断SM与SBE-β-CD已形成包合物。
2.3.3红外光谱分析分别称取SM原料药、载体、物理混合物、包合物少许，与溴化钾（约mg）于玛瑙研钵中，在红外光灯下混合研磨均匀后，压片测定，进行红外光谱扫描，结果见图8。由图可知，SM于cm?1处出现的酚羟基（Ar-OH）峰（原料药的特征峰之一），包合物的红外图谱中未见SM特征吸收峰，其主要显示SBE-β-CD的特征峰，但包合物与物理混合物的图谱存在一定的差异，包合物中有4个峰发生蓝移σ：1.63、.12、.18、.45cm?1；有4个峰发生红移σ：.78、.10、.47、0.61cm?1；且增加了2个峰σ：.08、.02cm?1。物理混合物的红外图谱叠加了衰减的SM特征峰和SBE-β-CD特征峰，主要表现出SBE-β-CD的特征峰。结果显示，包合物与物理混合物图谱相比，峰的位移与强度均发生了变化，且有新的吸收峰产生，证明SM与SBE-β-CD形成了包合物。
2.3.4X-射线衍射法取SM、SBE-β-CD、物理混合物以及SM-SBE-β-CD包合物粉末进行X-射线衍射分析，工作条件：CuKa靶，石墨单色器衍射单色化，管电压50kV，管电流20mA，结果见图9。由图可知，SM原料药在18～32℃处有连续的结晶衍射峰，SBE-β-CD无结晶峰，物理混合物中原料药的结晶峰有一定的减弱，但依然可见，包合物中原料药的结晶峰消失，说明在包合物中药物可能以非晶型或无定型的形式存在，推测药物被包合进SBE-β-CD中。
3讨论
5种指标性成分的对照品溶液在～nm内的紫外光谱扫描结果显示，其最大吸收波长在nm，而SBE-β-CD在此波长处无吸收，不干扰测定。故将检测波长定为nm。
SB和ISB均有一对异构体，参考文献报道[9]及SM胶囊（Legalon?，德国马博士药厂）的质量标准（JX30199），在含量测定时SB和ISB的峰为其异构体的2个峰相加。
通过相溶解度法实验发现，SBE-β-CD与SM的物质的量比约为6∶1，远大于二者1∶1的包合比。这样的结果与文献报道[10]中多个难溶性药物与β-CD包合实验的结果相似，提示可以通过对包合工艺参数和条件的优化来减少环糊精的用量。
本研究用HPLC法分别测定TF、SC、SD、SB和ISB的包合率，能够更加真实、准确地反映其各有效成分的包合情况[11]。SM的包合效果主要由各有效成分的包合率及包合物得率反映，因此，综合评分中根据各有效成分的药效作用强弱及含量多少确定其权重系数[8]，SB的含量最高，药效作用也最强，即TF、SC、SD、SB、ISB的包合率所占权重系数分别为0.03、0.15、0.04、0.51和0.07，包合物得率的权重为0.2。综合包合率及包合物得率评价包合工艺，多方面多指标评价包合工艺。5个有效成分中除主要活性成分SB外其他4个成分的包合率低且相差不大的原因可能是它们的相对分子质量比较接近，都在左右，推测进入环糊精分子空腔时各成分之间会存在竞争。5个有效成分的极性相差不大（SD＞TF＞ISB＞SC＝SB），环糊精分子的空腔是呈疏水性的，极性小的药物更容易被包合；药物的含量越高，包合上的机率也会越大，SB的含量是SC的3倍多，其他3种成分的含量也远低于SB，因此，SB的竞争力会强于其他4个成分。
药物分子进入环糊精空腔后，其结晶性会降低甚至失去；同时环糊精分子本身也会因包合了药物分子而使自身的晶体状态、空间结构及特定位置等发生改变，因此可通过显微镜或扫描电镜来观察包合前后环糊精或药物的形态变化[12-13]，从而初步判断是否形成了包合物。通过红外光谱法和X-射线衍射法测定结果，可进一步确定SM包合进入SBE-β-CD空腔内形成了包合物，而非单纯的吸附结合作用。
参考文献（略）
来源：周桂芝，吴珏，杨雪晗，陈珍珍，刘志宏，宋洪涛.水飞蓟素-磺丁基-β-环糊精包合物的制备[J].中草药,,50(17):4-
